Nuevos Materiales de Conversión Ascendente para Fotoquimioterapia con Complejos de Metales de Transición

Silvia Alonso-de Castro, Emmanuel Ruggiero, Luca Salassa

CIC biomaGUNE, Theranostic Nanomedicine Laboratory.

Debido a la decisión de celebrar el 2015 como el año de la luz es importante poner en relieve, una vez más, cómo la interacción de la luz con moléculas y materiales juega un papel crucial tanto en el desarrollo de vida como en una increíble variedad de aplicaciones fundamentales.

silviaemanueleluca

Nuestro trabajo actual está dirigido a la explotación de la luz y de los estados excitados de materiales híbridos para fines médicos. En particular queremos acoplar nanopartículas de conversión ascendente con profármacos anticancerígenos basados en metales de transición, una clase de agentes contra el cáncer con propiedades únicas. El objetivo es activar con luz de alta penetración (infrarrojo cercano) los efectos biológicos de estas pequeñas moléculas y, posiblemente, mejorar la eficacia de los tratamientos disminuyendo efectos secundarios no deseados.

La terapia fotodinámica

El éxito de la terapia fotodinámica (PDT, photodynamic therapy en inglés) ha atraído mucha atención sobre el uso de la luz y de las reacciones fotoquímicas para aplicaciones en medicina.[1] La PDT hace un uso combinado de la luz y un fotosensibilizador (Figura 1a) para convertir el oxígeno celular de su estado fundamental triplete (3O2) al estado excitado singlete (1O2, Figura 1b). El 1O2 reacciona con varios componentes celulares y puede generar eficazmente especies reactivas de oxígeno (ROS, reactive oxygen species) que inducen el estrés oxidativo, provocando la muerte de células cancerosas directamente irradiadas así como el cierre de los vasos sanguíneos tumorales.[2]

La activación de profármacos con luz permite el control temporal y espacial con respecto a la entrega y la aplicación de la terapia contra el cáncer, ya que la acción de las especies biológicamente activas se desencadenaría exclusivamente en las áreas irradiadas. Además, los efectos biológicos generados por la PDT son muy atractivos desde un punto de vista médico. Por ejemplo, la relativa falta de resistencia inducida por la PDT y un proceso de curación que implica la regeneración de los tejidos normales, en lugar de dejar cicatrices, son ventajas que hacen de la PDT una opción terapéutica viable para una amplia gama de tumores en combinación o como una alternativa a los tratamientos más consolidados.[3]

“El desarrollo de nuevos profármacos, con diferentes mecanismos de acción de los fotosensibilizadores actualmente usados en PDT, podría conducir a superar algunos de los inconvenientes asociados a la PDT”

Figura 1: (a) Estructuras de fotosensibilizadores aprobados para PDT. (b) Diagrama de los estados excitados de un fotosensibilizador genérico junto con O2 y mecanismo de conversión 3O2  → 1O2

Figura 1: (a) Estructuras de fotosensibilizadores aprobados para PDT. (b) Diagrama de los estados excitados de un fotosensibilizador genérico junto con O2 y mecanismo de conversión 3O2  → 1O2

.A pesar de su éxito y de algunos desarrollos prometedores, la PDT tiene varios inconvenientes, que actualmente limitan la eficacia del tratamiento. Tales limitaciones, se deben a las propiedades fotofísicas y fotoquímicas de los fotosensibilizadores, así como a sus efectos biológicos. Por ejemplo, i) la longitud de onda de absorción de luz es demasiado corta para lograr una penetración óptima en el tejido, ii) el coeficiente de extinción de los fotosensibilizadores es demasiado bajo, y iii) los pacientes sufren una larga fotosensibilización después del tratamiento debido a la baja eliminación del fármaco. Además, la dependencia del oxígeno molecular es en última instancia, la limitación clave para la eficacia de la PDT, ya que los tejidos tumorales son a menudo hipóxicos (carentes de oxígeno) y normalmente se produce el agotamiento del oxígeno durante el tratamiento PDT, un fenómeno que reduce la eficacia de la terapia.

“Las nanopartículas pueden captar y convertir la luz de baja energía en electrones o luz visible, facilitando así la transformación de la fotoquimioterapia en una metodología viable para el tratamiento de lesiones en profundidad”

Complejos metálicos fotoactivables como agentes antitumorales

Desde el descubrimiento de las propiedades antitumorales del cisplatino y el desarrollo de sus derivados de segunda y tercera generación, carboplatino y oxaliplatino respectivamente, los complejos metálicos se han convertido en una herramienta fundamental para la cura de diferentes tumores. Por esto, se han llevado a cabo una gran cantidad de estudios a lo largo de los últimos años sobre fármacos basados en platino y rutenio, que han facilitado la explotación fotoquímica de complejos metálicos con el objetivo de desarrollar profármacos innovadores y activables con luz.[4]

Con el fin último de usar esta tecnología en fotoquimioterapia los complejos deben ser estables e inocuos en la oscuridad bajo condiciones fisiológicas, pero al mismo tiempo tienen que ser capaces de generar especies citotóxicas dirigidas a las funciones claves de las células tras su activación mediante la luz. Las diferencias en citoxicidad en presencia o ausencia de luz son la base del índice de fototoxicidad, un parámetro que marca la eficacia de los complejos metálicos como candidatos para profármacos fotoactivables.

Una nueva vía de explotación de este tipo de complejos fotactivables es la diversidad química para desencadenar nuevos mecanismos de muerte celular, independientes de la generación de 1O y ROS. De hecho, los complejos de metales de transición presentan una gran variedad de estados excitados accesibles, lo que resultaría en una amplia gama de reacciones químicas.[5]

El desarrollo de nuevos profármacos, con diferentes mecanismos de acción de los fotosensibilizadores actualmente usados en PDT, podría conducir a superar algunos de los inconvenientes asociados a la PDT y mencionados anteriormente.

Figura 2: (a) Selección de complejos de metales de fotoactivables con actividad antineoplásica. (b) penetración de la luz en los tejidos a diferentes longitudes de onda.

Figura 2: (a) Selección de complejos de metales de fotoactivables con actividad antineoplásica. (b) penetración de la luz en los tejidos a diferentes longitudes de onda.

Diferentes tipos de complejos fotoactivables han sido desarrollados recientemente para usos relacionados con la biología y la medicina y en particular como agentes anticancerígenos. Concretamente, los complejos de Pt, Rh y Ru (Figura 2a) resaltan entre los compuestos más prometedores in vitro y que incluso en algunos casos se han empleado para estudios in vivo.

Un ejemplo significativo son los derivados de Pt(IV) con ligandos azida y entre ellos el trans,trans, trans-[Pt(N3)2(OH)2(NH3)(py)] destaca por sus propiedades antineoplásticas. Este compuesto es muy estable en condiciones fisiológicas y actúa como un profármaco de Pt(II) que en el oscuridad no es tóxico y no produce cambios en la morfología celular. Sin embargo, bajo irradiación con luz (hasta 420 nm), desencadena un mecanismo de muerte celular relacionado con la autofagia. Su actividad ha sido comprobada en un gran número de líneas celulares, y a nivel molecular su acción se debe a la reducción de Pt(IV) a Pt(II) inducida por dicha irradiación. A diferencia del cisplatino, el trans,trans,trans-[Pt(N3)2(OH)2(NH3) (py)] presenta efectos biológicos diferentes, principalmente porque los aductos que forma este último con ADN son totalmente distintos.[7]

Cabe destacar, que este complejo de Pt(IV) es activo en ratones portadores de carcinoma de esófago (OE19) cuando es irradiado con luz visible (420 nm). Además, este complejo se puede administrar en una dosis diez veces superior a la dosis máxima tolerada de cisplatino, sin encontrar ningún efecto negativo en el comportamiento de los ratones. Por ejemplo, no hay fototoxicidad oculocutánea, demostrando que trans,trans,trans-[Pt(N3)2(OH)2(NH3)(py)] es activo in vivo y podría provocar menores efectos secundarios comparado con otros agentes.[7]

Al igual que la gran mayoría de complejos, trans,trans,trans-[Pt(N3)2(OH)2(NH3) (py)] tiene una limitación muy importante, debida a que sus propiedades de absorción son inadecuadas, o por lo menos no son óptimas, para aplicaciones biomédicas. Por tanto, es crucial encontrar soluciones que permitan resolver tal limitación para avanzar en el uso de complejos metálicos fotoactivos en fotoquimioterapia. Por otro lado, una alta capacidad de absorción en la parte roja del espectro visible, o mejor en el infrarrojo cercano (NIR, near infrared), es fundamental para maximizar la eficacia (es decir, mayor penetración, Figura 2b) de agentes anticancerígenos fotoactivos a base de metales en tejidos cancerosos. De este modo, la obtención de complejos metálicos que presenten una buena absorción en el visible, junto con el aumento de su estabilidad en el estado fundamental y la mejora de su fotorreactividad, es un reto que en la mayoría de los casos requiere una solución de compromiso.[5]

Nuevas estrategias de fotoactivación: nanopartículas de conversión ascendente

En los últimos años, una estrategia prometedora que persigue superar las limitaciones de los complejos fotoactivables en términos de propiedades de absorción implica el uso de nanopartículas (por ejemplo, puntos cuánticos) que puedan captar y convertir la luz de baja energía en electrones o luz visible, facilitando así la transformación de la fotoquimioterapia en una metodología viable para el tratamiento de lesiones en profundidad.[1,3] Es importante destacar que las nanopartículas pueden ser explotadas simultáneamente como nanoplataformas para la liberación de fotosensibilizadores o profármacos fotoactivables a tejidos específicos y a compartimentos celulares. Además, pueden actuar al mismo tiempo como sondas diagnósticas para la formación de imágenes.

En este marco, nuestro grupo ha comenzado recientemente a investigar el uso de nanopartículas de conversión ascendente (UCNPs, upconversion nanoparticles en inglés) como medio de activación de la fotoquímica de complejos de metales de transición que son biológicamente relevantes.[8,9]

Las UCNPs son nanocristales dopados con lantánidos que promueven procesos ópticos no lineares como la emisión de fotones de alta energía (en el visible y ultravioleta) después de la absorción secuencial de dos o más fotones en el infrarrojo cercano.
En la óptica linear estándar, los fotones absorbidos por un fluoróforo se emiten a mayor longitud de onda (desplazamiento de Stoke) porque el sistema pierde energía durante el decaimiento del estado excitado al estado fundamental. Este proceso se define como luminiscencia (fluorescencia o fosforescencia dependiendo de la naturaleza del estado excitado). Por el contrario, la conversión ascendente (upconversion) implica la absorción de dos o más fotones y la subsiguiente emisión de un solo fotón a la longitud de onda más corta, es decir a mayor energía (desplazamiento de Anti-Stokes, Figura 3a). Tal fenómeno está basado en diferentes mecanismos que pueden implicar absorción en el estado excitado, transferencia de energía, y avalancha de fotones. En resumen, las UCNPs son nanomateriales que tienen la capacidad de emitir fotones en la región ultravioleta y visible bajo excitación en el infrarrojo cercano.[10]

“Las UCNPs pueden mejorar el impacto terapéutico de los complejos fotoactivables combinándolos al diseño de sistemas teranósticos”

En general, las UCNPs se componen de una matriz hospedadora con elementos lantánidos dopantes en una baja concentración. La matriz juega un papel crucial en la definición de las propiedades ópticas de estas partículas, ya que determina la posición espacial relativa, el número de coordinación, y el ambiente químico de los iones dopantes. Una matriz ideal debe ser estable químicamente, y tener baja energía fonónica al fin de reducir el decaimiento no radiativo y aumentar la eficiencia de la emisión de la conversión ascendente. Las mejores matrices hospedadoras son generalmente una combinación de fluoruros de metales alcalinos y de tierras raras (Na+, Ca2+, Gd3+ y Y3+). Esto es debido a que estos elementos tienen los mismos radios iónicos que los dopantes de tierras raras, ofreciendo la posibilidad de aumentar la estabilidad de las nanopartículas y reducir los defectos cristalinos.[10,11]

Figura 3: (a) Espectros de emisión de NaYF UCNPs dopadas con Yb3+/Er3+ (arriba) y Yb3+/Tm3+ (abajo) tras la excitación a 980 nm. (b) Mecanismo de la conversión ascendente en UCNPs dopadas con iones Yb3+, Tm3+ y Er3+.

Figura 3: (a) Espectros de emisión de NaYF UCNPs dopadas con Yb3+/Er3+ (arriba) y Yb3+/Tm3+ (abajo) tras la excitación a 980 nm. (b) Mecanismo de la conversión ascendente en UCNPs dopadas con iones Yb3+, Tm3+ y Er3+.

Los dopantes se pueden dividir en absorbedores y emisores dependiendo de su función. El ion absorbedor más utilizado es el Yb3+, aunque el Gd3+ también es comúnmente empleado, en particular, si se quieren obtener nanopartículas paramagnéticas que puedan ser usadas como sondas MRI. Ellos son responsables de la absorción de luz NIR (980 nm) y de la transferencia de energía al emisor de iones. Con el fin de maximizar el proceso de la conversión ascendente, los iones absorbedor y emisor deben tener niveles de energía compatibles. El emisor es el elemento responsable de la emisión en el UV-Vis, a través de la relajación radiativa desde sus estados excitados (Figura 3b). Un emisor ideal tiene estados excitados con un tiempo de vida largo (cientos de μs o ms), con el fin de permitir una absorción secuencial de fotones y la población de los estados excitados de alta energía. Elementos lantánidos que cumplen estos criterios son, por ejemplo, Er, Tm, y Ho. Se pueden obtener UCNPs con diferentes espectros de emisión mediante la variación de la composición de los lantánidos de dopaje o de la matriz de acogida. Las nanopartículas que muestran conversión ascendente más eficiente son de NaYF4 dopadas con Yb3+/Tm3+ (azul), Yb3+/Er3+ (verde) y Yb3+/Ho3+ (rojo).[10,11]

Proyectos en curso en CIC biomaGUNE

Nuestro grupo está investigando el acoplamiento de nanopartículas de conversión ascendente con complejos de metales fotoactivables dotados de actividad antineoplástica por el enorme potencial de estos sistemas en nanomedicina. Las UCNPs pueden mejorar el impacto terapéutico de los complejos fotoactivables combinándolos al diseño de sistemas teranósticos, donde el complejo metálico actúa como un profármaco terapéutico y las nanopartículas como una fuente de luz en el infrarrojo cercano, como una plataforma de entrega y como un agente multimodal de imágenes (por ejemplo, ópticos y MRI).

A pesar de las propiedades fotofísicas prometedoras de las UCNPs, aún hay muy poca literatura sobre sus usos como activadores de moléculas fotoquímicamente activas. Se han desarrollado hasta ahora varios materiales fotosensibles basados en UCNPs que utilizan andamios orgánicos como los basados en ditienileteno[12] mientras que el uso de moléculas inorgánicas ésta mucho menos explorado. El primer ejemplo que utiliza moléculas inorgánicas ha sido reportado por Ford y colaboradores que han demostrado la liberación de NO mediada por UCNPs a partir de la sal inorgánica [NH4][Fe4S3(NO)7] (sal negro de Roussin).[13]

En este marco, recientemente empezamos a investigar si las UCNPs pueden ser explotadas para fotoactivar complejos de rutenio polipiridílicos, una clase de compuestos con importantes propiedades biológicas.[14] Se seleccionó el complejocis-[Ru(bpy)2(py)2][Cl]2, donde bpy = 2,2´-bipiridina y py = piridina, por su capacidad de liberar de manera eficiente un ligando piridilo y permitir la formación, en solución acuosa, del aquo derivado cis-[Ru(bpy)2(py)(H2O)][Cl]2mediante excitación con luz.

Notablemente, cis-[Ru(bpy)2(py)2][Cl]2 sirve como un modelo para los complejos de rutenio polipiridílicos biológicamente activos, ya que los sistemas basados en cis-[Ru(bpy)2(L)2] y en otras estructuras relacionadas se están convirtiendo en compuestos jaula prometedores para la liberación de neuroquímicos y otros ligandos bioactivos con aplicaciones en la estimulación neuronal, en la inhibición de proteínas y en la terapia del cáncer.[15,16]

De hecho hemos sido capaces de demostrar que NaYF :Yb3+/Er3+ UCNPs son adecuadas para activar con luz infrarroja cercana la foto química de este sistema molecular y obtener el fotoproducto esperado. El solapamiento entre el espectro de absorción de cis-[Ru(bpy)2(py)2][Cl]2 y el perfil de luminiscencia de las UCNPs, destacan la idoneidad de la emisión de estas nanopartículas de aproximadamente 90 nm de diámetro para activar la fotoquímica del complejo. Las simples interacciones electrostáticas entre el complejo cargado y las nanopartículas permiten que la fotorreacción tenga lugar y el ligando piridina se libere.

Figura 4: Representación esquemática del mecanismo de funcionamiento del sistema fotoactivable UCNP-Pt(IV) desarrollado recientemente en nuestro laboratorio.

Figura 4: Representación esquemática del mecanismo de funcionamiento del sistema fotoactivable UCNP-Pt(IV) desarrollado recientemente en nuestro laboratorio.

Después de este éxito inicial, ampliamos la aplicación de estos nanomateriales demostrando que las UCNPs pueden mediar la fotoactivación en el NIR de complejos de Pt(IV) precursores de cisplatino, como el derivado cis,cis,trans-[P-t(NH3)2(Cl)2(O2CCH2CH2CO2H)2]. Esta familia de compuestos es representativa de una clase de profármacos candidatos a agentes antitumorales y han alcanzado etapas avanzadas de ensayos clínicos. En este reciente estudio, la decoración de la superficie de las UCNPs NaYF :Yb3+/Tm3+ con el profármaco de Pt(IV) se ha logrado mediante la conjugación de tal complejo a un fosfolípido pegilado (DSPE-PEG (2000)-NH2) y la formación de un aducto capaz de interactuar con los ligandos hidrófobos que rodean las partículas (Figura 4).[9]

Experimentos de fotólisis muestran que la luz infrarroja cercana puede promover la fotoactivación del complejo (aunque su absorción llegue sólo a 400 nm) y que la funcionalización con el fosfolípido pegilado parece ser una estrategia valiosa para desarrollar nanomateriales fotoactivables capaces de liberar especies activas de Pt(II), que son las que finalmente ejercen actividad anticancerígena.

Conclusiones

Aunque nos encontramos en los estados iniciales de esta investigación, los primeros resultados prometedores destacan claramente que las UCNPs ofrecen una estrategia viable para la activación de complejos metálicos en longitudes de onda más adecuadas para aplicaciones in vivo. Sin embargo, habremos de prestar cuidado a aspectos tales como las consecuencias del calentamiento por láser sobre los tejidos biológicos y la eficiencia de la conversión ascendente. Las UCNPs se basan en la transferencia de energía para la activación de complejos metálicos, por lo tanto, el solapamiento entre la emisión del donante y la absorción del aceptor así como la proximidad entre ellos son parámetros de optimización innegociables.

La baja toxicidad (tanto in vitro como in vivo) de UCNPs con respecto a otros nanomateriales y su capacidad de imagen multimodal (MRI/PET/optical) son ventajas clave para su explotación en nuevas aplicaciones nanomédicas. En este sentido, estamos abordando algunos de estos asuntos, y hemos iniciado la investigación de las capacidades de imagen del sistema UCNP-Pt(IV) desarrollado.

La optimización de los aspectos anteriormente mencionados nos ofrece la oportunidad de lograr diferentes avances que allanen el camino para el diseño de materiales fotoactivables para los diagnósticos con fines terapéuticos a base de complejos metálicos y UCNPs.

Referencias

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