Microsensores basados en redes de nanoagujeros

Josu Martinez-Perdiguero1, Deitze Otaduy1,2, Aritz Retolaza1,2 y Santos Merino1,2.

1 CIC microGUNE, Arrasate-Mondragón, España.

2 Unidad de Micro y Nanofabricación, IK4-Tekniker, Éibar, España.

En CIC microGUNE se investiga en una serie de microsensores novedosos basados en efectos plasmónicos producidos en superficies metálicas nanoestructuradas. Estos microdispositivos ofrecen grandes ventajas como gran sensibilidad, potencial de miniaturización y capacidad de detección sin marcadores en tiempo real. Además, la escalabilidad de las técnicas de fabricación empleadas los convierten en grandes candidatos para una futura industrialización.

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Una nueva generación de microsensores basados en efectos plasmónicos está a las puertas de irrumpir en multitud de aplicaciones hoy en día dominadas por otros métodos de sensado convencionales. Estos nuevos microsensores ópticos serán más sensibles, más pequeños, más rápidos y capaces tanto de detectar varios compuestos simultáneamente como de funcionar de manera continua en tareas de monitorización. La ciencia de estos microsensores se encuentra en la interacción especial de la luz con nanoestructuras como nanoagujeros, nanoantenas o nanopartículas de dimensiones inferiores a la longitud de onda. Los campos electromagnéticos en la cercanía de las nanoestructuras, producidos por la incidencia de luz, se ven fuertemente afectados por el medio que los rodea, un efecto que puede ser aprovechado para detectar la presencia de determinados compuestos de interés en una muestra en proporciones extremadamente pequeñas. A pesar de que las pruebas de concepto de estos microsensores ya están realizadas, métodos de fabricación a escala nanométrica de alto rendimiento son necesarios para el despegue de esta tecnología. En microGUNE, se investiga en el desarrollo y la optimización de estos microsensores del futuro.

Introducción

Bajo unas condiciones determinadas, la luz incidente en determinados metales puede dar lugar a ondas de electrones que se propagan de manera muy confinada en la superficie. Estas ondas son conocidas como plasmones superficiales (PS) y las condiciones para su generación (condiciones de resonancia) son extremadamente sensibles a las propiedades ópticas del entorno inmediato que les rodea. Este fenómeno se puede utilizar para desarrollar sensores ópticos y, de hecho, los sensores basados en resonancia de plasmones superficiales (SPR por sus siglas en inglés) son un instrumento común en muchos laboratorios principalmente para la monitorización de interacciones moleculares en tiempo real sin la necesidad de marcadores (label-free).

Figura 1. Simulación de la interacción de las ondas electromagnéticas con el chip sensor. Se muestra la densidad de energía asociada a la excitación del plasmón superficial, longitud de onda de resonancia. Los cálculos se realizan mediante simplificación por simetrías para reducir el costo computacional.

Figura 1. Simulación de la interacción de las ondas electromagnéticas con el chip sensor. Se muestra la densidad de energía asociada a la excitación del plasmón superficial, longitud de onda de resonancia. Los cálculos se realizan mediante simplificación por simetrías para reducir el costo computacional.

Típicamente las condiciones de resonancia para acoplar la luz incidente con los PS se han conseguido utilizando la conocida configuración de Kretschmann en la que una capa lisa de unos 50 nm de oro es depositada sobre un prisma. Variando el ángulo de incidencia se consigue, en las condiciones de resonancia, un pico de absorción en la intensidad de luz reflejada, la cual se transforma en PS. Como se puede intuir, al necesitar una configuración no lineal y tener que controlar el ángulo de incidencia de la luz con gran precisión, se requiere de un montaje óptico relativamente complejo. Sin embargo, existen otros métodos para acoplar la luz a los PS incluso más sensibles. Entre ellos, destaca el uso de redes periódicas de nanoagujeros con dimensiones menores que las longitudes de onda de la luz incidente. Según la óptica clásica basada en los principios clásicos de la luz como onda electromagnética, la intensidad de luz trasmitida a través de estos agujeros debería ser prácticamente nula, mucho menor de la que es observada en la realidad. Este efecto es conocido como transmisión óptica extraordinaria y es un fenómeno mediado por la propagación de PS, también llamado resonancia de plasmones localizados (LSPR, de sus siglas en inglés). La luz se transmite de manera lineal y perpendicular al sustrato estructurado, lo que simplifica en gran medida la óptica necesaria facilitando la posible miniaturización e integración de un microsistema sensor. Además, el tamaño de estas redes altamente sensibles es de unas pocas micras cuadradas, lo que dispara las posibilidades de multiplexado al poder crear en pequeños chips un altísimo número de redes independientes capaces de sensar diferentes compuestos simultáneamente. Esto posibilita, por ejemplo, en el campo de la salud, la detección en una única medida de enfermedades caracterizadas por la presencia de varios biomarcadores.

Principios básicos de los plasmones superficiales

Figura 2. Fotografía de dos redes de nanoagujeros de 500x500 μm2 del máster para la fabricación de chip con capacidad multiplexada. El color de diferente de las redes se debe al efecto de difracción de la luz sobre dos nanoestructuras con distintos periodos. En cada una de estad redes hay aproximadamente 1 millón de nanoagujeros. superficial, longitud de onda de resonancia. Los cálculos se realizan mediante simplificación por simetrías para reducir el costo computacional.

Figura 2. Fotografía de dos redes de nanoagujeros de 500×500 μm2 del máster para la fabricación de chip con capacidad multiplexada. El color de diferente de las redes se debe al efecto de difracción de la luz sobre dos nanoestructuras con distintos periodos. En cada una de estad redes hay aproximadamente 1 millón de nanoagujeros. superficial, longitud de onda de resonancia. Los cálculos se realizan mediante simplificación por simetrías para reducir el costo computacional.

La geometría de las redes periódicas de nanoagujeros es crucial a la hora de diseñar nanosensores con sensibilidades optimizadas y que trabajen en la zona del espectro óptico de interés.

Figura 3. Esquema del proceso NIL donde se muestran los pasos necesarios para llevar a cabo la fabricación de redes de nanoagujeros de oro.

Figura 3. Esquema del proceso NIL donde se muestran los pasos necesarios para llevar a cabo la fabricación de redes de nanoagujeros de oro.

Una gran parte de trabajos relacionados con este tipo de sistemas son investigaciones teóricas donde se simulan patrones más o menos complejos en la búsqueda de periodicidades, simetrías, tamaño de agujero, materiales u otros parámetros optimizados. Por su simplicidad y validez como prueba de concepto de la tecnología, en microGUNE se trabaja con redes cuadradas con periodicidades de 375-600 nm y tamaños de agujero de 100-250 nm. Las capas finas de oro necesarias para crear estas estructuras tienen espesores de 50-100 nm. Las posiciones de las distintas resonancias para redes de este tipo vienen dadas por la siguiente fórmula:

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donde i y j son dos números enteros que describen las resonancias de distintos ordenes, p es la periodicidad de la red y Es y Em son las permitividades dieléctricas del medio en contacto con la red (aire, agua…) y del oro respectivamente.

Figura 4. Fotografía de microscopio electrónico de una red de nanoagujeros de oro.

Figura 4. Fotografía de microscopio electrónico de una red de nanoagujeros de oro.

Utilizando los principios teóricos se realizan simulaciones computacionales para calcular las geometrías óptimas de mayor sensibilidad a ser fabricadas para cada aplicación. Así, mediante cálculos FDTD (finite-difference time-domain) se calcula la distribución del campo eléctrico perpendicular a la superficie del oro nanoestructurado y densidad de energía asociadas a la excitación del PS (ver Figura 1). También se estudia el estrechamiento y la posición de las resonancias en función del periodo de la red de nanoagujeros, además de calcular el decaimiento del campo evanescente con la distancia. Para aumentar la sensibilidad en ciertos casos, se estudia el efecto que tiene sobre la sensibilidad el hecho de trabajar con substratos con índice de refracción más pequeños que el vidrio.

Figura 5. Esquema del montaje óptico experimental para la medida del espectro de transmisión a través de las redes de nanoagujeros fabricada. Todas las medidas son realizadas en un ambiente controlado en temperatura y humedad. Figura 5. Esquema del montaje óptico experimental para la medida del espectro de transmisión a través de las redes de nanoagujeros fabricada. Todas las medidas son realizadas en un ambiente controlado en temperatura y humedad.

Figura 5. Esquema del montaje óptico experimental para la medida del espectro de transmisión a través de las redes de nanoagujeros fabricada. Todas las medidas son realizadas en un ambiente controlado en temperatura y humedad.

Fabricación de las nanoestructuras sensoras

 La cantidad de trabajos de investigación sobre nanosensores basados en resonancia de plasmones superficiales durante los últimos años ha crecido drásticamente. Este hecho está estrechamente unido al desarrollo de la capacidad de fabricación de nanoestructuras tanto mediante métodos “top-down” como “bottom-up”. Dentro de las técnicas de micromecanizado “top-down” que permiten el diseño ad hoc de nanoestructuras, las más utilizadas son la litografía por haz de electrones (EBL) y el haz de iones focalizado (FIB). El EBL “escribe” sobre una resina sensible, normalmente polimetilmetacrilato (PMMA), depositada sobre el sustrato de interés para, a continuación, revelarla y procesar el sustrato mediante técnicas convencionales de microfabricación. A diferencia del EBL, el FIB nanoestructura directamente capas finas mediante el bombardeo con iones de galio. Además de resoluciones de unos pocos nanómetros, ambas técnicas permiten un control casi total de la forma y el tamaño de las estructuras.
En los últimos años han aparecido una serie de técnicas conocidas como litografías alternativas que se presentan como posibles candidatas a medio plazo para la fabricación de alto rendimiento de estructuras nanométricas como las necesarias para el desarrollo de esta nueva generación de nanosensores basados en PS. Uno de los ejes principales de la estrategia de microGUNE es la generación de conocimiento sobre este tipo de métodos de nanofabricación debido principalmente a su potencial industrialización e impacto. Destacan el template stripping y la más madura litografía de nanoimpresión (NIL) las cuales son empleadas en la fabricación de las redes de nanoagujeros para el desarrollo de nanosensores.
En el proceso de template stripping una fina capa de oro altamente uniforme y de muy baja rugosidad es evaporada mediante una evaporadora por haz de electrones sobre el molde patrón nanoestructurado (ver Figura 2) y una resina curable es depositada en un vidrio. El molde y el vidrio se ponen en contacto y la resina epoxi es curada por medio de luz UV. Debido a la mejor adhesión del oro a la resina epoxi que al silicio, el oro en contacto con la resina queda adherido sobre el substrato formado por el vidrio y la resina de manera que las estructuras presentes en el molde se transfieren al vidrio, formando en este caso las redes de nanoagujeros.

Por otro lado, el proceso NIL se basa en la transferencia de las estructuras nanométricas presentes en el molde patrón (ver el esquema de la Figura 3). Para ello, el sustrato se cubre con una fina capa de resina y se pone en contacto con el molde (Figura 3a). Controlando las condiciones de presión y temperatura, el polímero fluye dentro de las estructuras del molde, para a continuación, proceder a un desmoldeo controlado que deja la resina nanoestructurada (Figura 3b). Un paso crítico es el ataque mediante plasma de oxígeno de la llamada capa residual de resina que permanece tras el desmoldeo (Figura 3c). Tras este paso, la resina remanente actúa como máscara para depositar la capa fina de oro necesaria (Figura 3d) y la resina es eliminada mediante un proceso de liftoff (Figura 3e). En la Figura 4 se muestra una imagen SEM de una red fabricada mediante esta técnica.

Figura 6. Espectro de transmisión centrado en la longitud de onda de resonancia para la red estudiada para seis concentraciones diferentes de sacarosa de índice de refracción conocido. Se puede apreciar un claro desplazamiento hacia el infrarrojo, longitudes de onda mayores, a mayor concentración de sacarosa, mayor índice de refracción de la muestra.

Figura 6. Espectro de transmisión centrado en la longitud de onda de resonancia para la red estudiada para seis concentraciones diferentes de sacarosa de índice de refracción conocido. Se puede apreciar un claro desplazamiento hacia el infrarrojo, longitudes de onda mayores, a mayor concentración de sacarosa, mayor índice de refracción de la muestra.

Caracterización de los nanosensores

Tras el proceso de fabricación, hay que llevar a cabo la caracterización óptica de las redes. Para ello se trabaja sobre un banco óptico lineal como el esquematizado en la Figura 5 en el que un haz de luz es focalizado sobre el chip de oro estructurado con la red de nanoagujeros. Los espectros de transmisión son estudiados mediante un espectrofotómetro. Para facilitar las medidas con distintas soluciones se emplea una celda microfluídica. En la Figura 6 se muestra la resonancia de primer orden para una de las redes fabricadas y la variación de la longitud de onda con el índice de refracción del medio en contacto. En este caso se han utilizado soluciones calibradas que permiten calcular la sensibilidad de la red, la cual está próxima a los mejores valores encontrados en el estado del arte y son aproximadamente 500 nm por unidad de índice de refracción (nm/RIU).

Figura 7. Representación de las longitudes de onda de resonancia experimental frente a simulada para una red de nanoagujeros. Se puede observar una buena correspondencia, lo que indica que las simulaciones son un buen soporte para definir las características óptimas de las nanoestructuras en función de la aplicación.

Figura 7. Representación de las longitudes de onda de resonancia experimental frente a simulada para una red de nanoagujeros. Se puede observar una buena correspondencia, lo que indica que las simulaciones son un buen soporte para definir las características óptimas de las nanoestructuras en función de la aplicación.

Además de comparar las longitudes de onda de resonancia obtenidas para las distintas redes fabricadas entre sí, se comprueba que dichas longitudes de onda obtenidas experimentalmente concuerdan con las calculadas mediante simulación. Como muestra la Figura 7, para una red de periodo 450 nm y diámetro de agujeros de 200 nm inmersa en agua, la concordancia es alta lo que ratifica la validez de los procesos de fabricación y simulación.

Como se puede apreciar en los valores de las longitudes de onda de las figuras, las nanoestructuras se han diseñado de tal forma que las resonancias se encuentren en el espectro del visible. Teóricamente, aumentando el periodo de las redes, la longitud de onda de resonancia se desplaza hacia el infrarrojo cercano o medio y es posible aumentar la sensibilidad a la vez que se simplifica la fabricación debido a que las dimensiones críticas son mayores. Sin embargo, trabajar con longitudes de onda fuera del visible conlleva el inconveniente de tener que usar una instrumentación mucho más cara y delicada que necesita unas condiciones de trabajo más exigentes, encareciendo altamente el sistema. Esto hace que, a pesar del interés básico que pueda suscitar, quede fuera del objetivo de esta investigación que es desarrollar microsensores de bajo coste, portátiles, robustos y competitivos frente a técnicas estándar.

El rango de influencia de los PS es de unos 50 nm por lo que lo primero que se debe conseguir para poder detectar la presencia de un compuesto en una muestra es que dicho compuesto esté lo más cerca posible de la zona sensora, para ello se funcionaliza específicamente dicha zona para que este quede anclado dentro de la distancia mencionada. Así, hay que remarcar que la eficacia y sensibilidad de estos microsensores no sólo depende del dispositivo en sí, sino también de una adecuada funcionalización de la red sensora. En microGUNE, por tanto, se investiga horizontalmente tanto en el desarrollo de los microsensores como en protocolos óptimos de funcionalización para cada caso de estudio.

Figura 8. Monitorización a tiempo real de la adsorción de BSA sobre la superficie de oro. Evolución de la intensidad a una determinada longitud de onda en donde el cambio es más significativo. Se puede observar que la proteína de BSA se inyecta en t=150s lo que provoca un cambio de la intensidad, cuyo valor va a aumentando hasta que a t=700s aproximadamente la superficie de oro se satura y no se produce más adsorción de BSA, la intensidad tiende a un valor constante.

Aplicación y prueba de concepto

Una de las aplicaciones estudiadas y utilizada como prueba de concepto con estos microsensores basados en LSPR es la detección de citoquinas en suero asociadas a las enfermedades inflamatorias autoinmunes, como lo son la Interleuquina 6 (IL-6), Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNF-α), y la Interleuquina 12 (IL-12). El dato de la concentración de estas proteínas en suero se considera esencial para establecer un pronóstico sobre la cascada inflamatoria y así establecer un criterio basado en un objetivo molecular cuantificable para la administración de terapias basadas en anti-TNF alfa. Sin embargo, la concentración de estas proteínas en suero es muy baja y se requiere un sistema de detección de altísima sensibilidad, algo que hay día de hoy solo es posible en laboratorios altamente especializados.

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Los microsensores desarrollados no sólo tienen la capacidad de medir la concentración de compuestos de manera totalmente label-free, i.e., sin marcadores, sino que además, fijada una longitud de onda óptima, mediante la monitorización de la evolución de la intensidad, se pueden realizar medidas en tiempo real. Con el objetivo de demostrar dicha capacidad, en la Figura 8 se muestra la monitorización en tiempo real de la adsorción de proteínas en una superficie de oro. En este experimento en concreto, se incubaron 50 µg/ml de suero bovino (BSA, Bovine Serum Albumin) sobre un chip de nanoagujeros de diámetro 155 nm y periodo de red de 500 nm. La figura representa la intensidad transmitida a una longitud de onda fija (645 nm, precisamente donde se recoge el mayor cambio de señal) frente al tiempo de incubación donde se puede observar la cinética de absorción de BSA a la superficie de oro en un modo real-time label-free. En el momento en que se inyecta la muestra y la proteína es adsorbida en la superficie, la señal aumenta. Este aumento se da hasta llegar a una saturación donde la señal se estabiliza, indicando así la total ocupación de la superficie por la proteína.

Conclusiones y perspectivas

Los efectos plasmónicos que se generan debido a la interacción especial de la luz con nanoestructuras pueden ser utilizados como señales de transducción para una nueva generación de microsensores ultrasensibles. En microGUNE no sólo se está trabajando en la caracterización de estas interacciones para el diseño de las nanoestructuras óptimas sino que también se están desarrollando tecnologías de nanofabricación avanzas de alto rendimiento, de manera que la investigación se encamine hacia una futura industrialización. Las barreras tecnológicas y retos en el conocimiento que presentan este tipo de microsistemas están siendo superados, por lo que las perspectivas de éxito son alentadoras.

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