Biología Estructural: contribución al descubrimiento y desarrollo de nuevos antibióticos

David Albesa-Jove1, Javier O. Cifuente2 y Marcelo E. Guerin3

1Investigador Ikerbasque Fellow, en el Grupo de Glicobiología Estructural, UPV

2Investigador Post-doctoral, en el Grupo de Glicobiología Estructural, UPV

3 Profesor de Investigación Ikerbasque, y lider del Grupo de Glicobiología Estructural, UPV

Alexandre Yersin no lo dudó. El padre Bernardo Vigano pagó por los cuerpos y él corrió con su bisturí en mano. Abrió uno de ellos y, decidido, extrajo un bu- bón. Allí debía estar la respuesta. Y subió. Subió rápido hasta su laboratorio del Kennedy Town Hospital de Hong Kong, muy lejos de casa. Hizo un preparado y lo montó en su microscopio. Ese que siempre viajaba a su lado, a todas partes en su caja de madera. Miró ansioso. Un puré de microbios, todos parecidos con forma de bastones y extremos redondeados. Yersin descubría así al bacilo de  la peste que haría honor a su nombre, Yersinia pestis. Esa plaga que hasta en- tonces había diezmado la población mundial en varias ocasiones (Camus, 1947). Quizás al encontrarse luego con el padre Vigano lo abrazó. Quizás solo se dieron la mano. O quizás se sumió en un profundo silencio. No lo sabemos. Pero lo que sí sabemos es que el padre Vigano hizo construir para Yersin, un hombre de una energía inagotable, una precaria choza de bambú recubierta de paja cerca del Alice Memorial Hospital, también en Hong Kong, para que éste pudiera avanzar en sus investigaciones con total libertad. En una habitación Yersin instaló sus tubos de cultivo y sus animales de experimentación. En la otra, contigua, dormía él en una cama de campaña. Junto a su inseparable microscopio óptico. Así era Yersin (Mollaret y Brossollet, 1985; Deville, 2014; Figura 1).

Un año mas tarde Yersin se alojó en el mismo Instituto Pasteur de Paris, para intentar desarrollar la vacuna y el primer suero anti pestífero. Ya en Hong Kong intuyó que la inoculación de cepas poco o no virulentas, serían capaces de ge- nerar inmunidad contra la peste. Y en esa dirección trabajó muy duro junto con Émile Roux y Albert Calmette, consiguiendo establecer sus bases en poco más de tres meses. Tres años más tarde, muy lejos de allí, Paul-Louis Simond, que no las tenía todas consigo, se las ingenió en el Hotel Reynolds de Karachi (Simond et al., 1998), para descubrir que la pulga era la transmisora de la epidemia, ce- rrando así el circulo de su etiología. Yersin, que era un científico noble, felicitó a Simond. El descubrimiento de Yersin se sumaba al de muchos otros investigadores de la época, incluyendo el de Filippo Pacini y la bacteria que causaba el cólera en 1854, el de Robert Koch y el bacilo de la tuberculosis, en 1882 (Zumla et al., 2013a).

Figura 1. A. Esquema de Yersinia pestis tras ser visualizada con el microscopio óptico. B. Y. pestis visualizada mediante el microscopio electrónico actual. C. Esquema de Mycobacterium tuberculosis tras ser visualizada con el microscopio óptico. D. M. tuberculosis visualizada mediante el microscopio electrónico actual.

Figura 1. A. Esquema de Yersinia pestis tras ser visualizada con el microscopio óptico. B. Y. pestis visualizada mediante el microscopio electrónico actual. C. Esquema de Mycobacterium tuberculosis tras ser visualizada con el microscopio óptico. D. M. tuberculosis visualizada mediante el microscopio electrónico actual.

El microscopio óptico le permitió a Yersin responder a la pregunta acerca del origen de la peste. Sin embargo, ¿qué había mas allá? ¿Cómo estaba estructurada esa bacteria que acababa de descubrir? ¿Por qué podía causarle la muerte a una persona? ¿Qué es lo que la diferenciaba de aquella que causaba la tuberculosis descripta por Koch? ¿Por qué no se movía, a diferencia de lo que ocurría con la que causaba el cólera? ¿Qué es lo que la diferenciaba de una célula humana? No había dudas. Había que mirar más en profundidad. Adentrarse en la estructura de aquellas bacterias. Pero ¿cómo? Afortunadamente, la curiosidad, las ilusiones y la energía de muchos otros científicos que trabajaron a lo largo de los años permitieron desarrollar técnicas que nos han permitido ver mas allá de lo que Yersin pudo ver aquel 20 de Junio de 1894, bien entrada la tarde, cuando descubrió el bacilo de la peste. Dichas técnicas nos permitieron conocer que las bacterias están esencialmente compuestas de tres tipos de moléculas: los lípidos, los glicanos y las proteínas. Y que la variabilidad de sus estructuras químicas, su disposición en el espacio y su relación con el tiempo y su entorno, las diferencian unas de otras. Dentro de las técnicas que nos han permitido ver estas estructuras a nivel molecular, encontramos a la microscopia electrónica, la resonancia magnética nuclear, y otra particularmente fascinante que permitió un avance fundamental en el entendimiento de la estructura molecular de la materia viva: la cristalografía de rayos X (Blundell y Johnson, 1976; Figura 2).

“La biología estructural permite avanzar en el descubrimiento, desarrollo y comprensión de los mecanismos de acción de los antibióticos”

¿Que es la cristalografía de rayos X?

The  technique  explains  why  blood  is  red  and  grass  is  green;  why  diamond    is hard and wax is soft; why glaciers flow and iron gets hard when you hammer it; how  muscles  contract;  how  sunlight  makes  plants  grow  and  how  li-  ving  organisms  have   been  able  to  evolve   into  ever   more  complex    forms?

…  The  answers  to  all  these   problems   have   come   from  structural    analysis.’

Max Perutz, Julio de 1996, Churchill College, Cambridge

Estas fueron las palabras que Max Perutz escribió para poner de relevancia la importancia de la cristalografía de rayos X y su impacto en el conocimiento humano. La cristalografía de rayos X es el estudio de la estructura de los sólidos cristalinos y ha dado lugar al desarrollo de nuevas disciplinas como la Biología Molecular y la Biología Estructural. William Bragg y su hijo Lawrence Bragg fueron pioneros en el análisis de estructuras cristalinas mediante el uso de  rayos X. En 1913 formularon la relación geométrica existente entre la posición de los átomos en un cristal y el patrón de difracción que se desprende del mismo al ser irradiado con rayos X. En un artículo seminal titulado ‘The Reflection of X-rays by Crystals’ (Bragg y Bragg, 1913), describen el primer difractómetro de rayos X, por el cual fueron merecedores en 1915 del Premio Nobel en Física. Sin embargo, este concepto no hubiese sido posible sin el descubrimiento de los rayos X y su capacidad de ser difractados mediante cristales.

“El conocimiento de la estructura tridimensional de dianas terapéuticas permite el diseño racional de fármacos”

Durante 1895, es decir un año después del descubrimiento de Yersin, Wilhelm Röntgen estudiaba los efectos de los rayos catódicos en tubos de vacío. Para ello había oscurecido su laboratorio. En concreto, Röntgen descubrió, de una forma fortuita, que al aplicar la corriente eléctrica al tubo de vacío, una tenue luz era emitida sobre una poyata apartada del tubo sellado. Esta luz provenía de un trozo de papel cubierto con sal de platino-cianuro de bario, material fluorescente con el que Röntgen realizaba dichas experiencias. Se dió cuenta de que la intensidad de luz emitida por la sal aumentaba al aproximarla al tubo sellado, por lo que era claro que el estímulo del brillo procedía de algún tipo de radicación emitida en el tubo de vacío. Durante las semanas que siguieron, Röntgen estudió en detalle las propiedades de esta radiación invisible y desconocida que bautizó como rayos X — siguiendo la notación matemática de la X para lo desconocido. Descubrió que los materiales densos absorbían más radiación que aquellos menos densos, y que dicha radiación volvía negro el papel fotográfico. Justo antes de Navidades decidió tomar una radiografía de la mano de su esposa, donde se observaban con claridad los huesos y el anillo de oro en su dedo anular, estableciendo el nacimiento de la radiología médica. El 28 de diciembre de 1895 publicó ‘On A New Kind Of Rays’ describiendo su descubrimiento, un logro que le valió en 1901 el primer Premio Nobel en Física.

Röntgen intentó luego sin éxito reflejar los rayos X o focalizarlos con lentes ópticas. El desarrollo de la cristalografía tuvo que esperar hasta que otro físico alemán, Max von Laue, se preguntara esencialmente si los rayos X eran partículas u ondas. Si fuesen ondas deberían poder ser difractadas, al igual que la luz visible. Fue entonces cuando un alumno de Laue le habló acerca de los cristales, que se pensaba estaban compuestos por átomos dispuestos en forma ordenada. Laue intuyó que quizás ese orden cristalino pudiese ser capaz de permitir la difracción de los rayos X. Diseñó así el primer experimento de difracción de rayos X   a partir de cristales de sulfato de cobre. Estas primeras imágenes fotográficas demostraron no solo que los rayos X son ondas, sino también que los átomos que forman los cristales se encuentran ordenados. Por el descubrimiento de   la difracción de rayos X mediante el uso de cristales, Laue consiguió en 1914 el Premio Nobel en Física.

Los tiempos que siguieron fueron fascinantes. Max Perutz, un joven refugiado austríaco recién licenciado que llegó a Cambridge en 1936, fue persuadido con el enorme reto de resolver la estructura cristalina de una proteína, uno de los principales componentes de la célula, bajo la supervisión de John Desmond Bernal, quien a su vez fuera discípulo de William Bragg. Poco después, Bernal dejó Cambridge para trasladarse al Birkbeck College en Londres, dejando atrás a Perutz, quien fue a discutir su proyecto con Lawrence Bragg. Su proyecto re- presentaba para la época una verdadera tarea de soñadores, ya que la estructura cristalina más compleja resuelta hasta la fecha, 1937, estaba compuesta por solo 40 átomos. ¡Perutz pretendía resolver una estructura cristalina de aproximadamente 5.000 átomos! Lawrence Bragg decidió apoyar a Perutz en este gigantesco y maravilloso esfuerzo, que culminó 25 años más tarde con la resolución de la estructura de la hemoglobina, por lo cual recibió el Premio Nobel en Química en 1962. Este logro representó a su vez el esfuerzo colectivo de muchos otros científicos, incluyendo el de Dorothy Hodgkin, quien colectó los primeros datos de difracción de rayos X a partir de cristales de proteínas en 1934. Es interesante mencionar que en 1951, Linus Pauling y Robert Corey (Pauling y Corey, 1951) propusieron que los péptidos que conforman las proteínas se encuentran mayormente formando estructuras helicoidales (hélices-⍺) o planas (hebras-β). Dichos modelos, pudieron ser visualizados por primera vez gracias a la resolución de las estructuras de la mioglobina y de la hemoglobina en 1959, sentando las bases de la Biología Estructural.

El campo de la cristalografía ha evolucionando desde sus orígenes, en forma extraordinaria. Las fuentes de radiación de rayos X han sido perfeccionadas y robotizadas. Se han construido los sincrotrones (Figura 3). Los detectores han evolucionado drásticamente, siendo capaces en la actualidad de contar fotones con una exactitud absoluta. Se han desarrollado nuevos métodos de resolución y análisis estructural automatizados, en gran medida gracias al progreso en paralelo de la informática. Todos estos avances hacen hoy de la cristalografía de rayos X una técnica que impacta marcadamente en nuestro conocimiento de  la vida a nivel molecular. Un ejemplo claro es el impacto que ha tenido en el descubrimiento y desarrollo de los antibióticos.

Figura 3. A. Imagen aérea del sincrotron Diamond Light Source en Reino Unido. El edificio posee unos 738 metros de circunferencia. B. Un esquema de su interior, donde se muestra en la parte superior el gran anillo central por el cual viajan partículas aceleradas a velocidades cercanas a la luz, lo que genera emisión de haces de luz de alta energía (rayos X) con un brillo millones de veces mayor que el sol. Estos rayos X son dirigidos dentro de la linea experimental (enmarcada en rojo). Dentro de la linea, confinado en una habitación blindada a la radiación, el cristal, soportado en un goniómetro y enfriado por un flujo de nitrógeno a temperaturas criogénicas, es irradiado por la fuente de rayos X y su difracción colectada en un detector (enmarcado en naranja). C. El experimento en estos sincrotrones avanzados se realiza usando robots de última tecnología que manipulan desde cristales individuales (izquierda) hasta placas conteniendo cientos de cristales (derecha). Imá- genes por cortesía de Diamond Light Source.

Figura 3. A. Imagen aérea del sincrotron Diamond Light Source en Reino Unido. El edificio posee unos 738 metros de circunferencia. B. Un esquema de su interior, donde se muestra en la parte superior el gran anillo central por el cual viajan partículas aceleradas a velocidades cercanas a la luz, lo que genera emisión de haces de luz de alta energía (rayos X) con un brillo millones de veces mayor que el sol. Estos rayos X son dirigidos dentro de la linea experimental (enmarcada en rojo). Dentro de la linea, confinado en una habitación blindada a la radiación, el cristal, soportado en un goniómetro y enfriado por un flujo de nitrógeno a temperaturas criogénicas, es irradiado por la fuente de rayos X y su difracción colectada en un detector (enmarcado en naranja). C. El experimento en estos sincrotrones avanzados se realiza usando robots de última tecnología que manipulan desde cristales individuales (izquierda) hasta placas conteniendo cientos de cristales (derecha). Imá- genes por cortesía de Diamond Light Source.

El aporte de la biología estructural al descubrimiento, desarrollo y comprensión de los mecanismos de acción de los antibióticos.

La era de la quimioterapia antibacteriana comenzó en la primera década del 1900 con el descubrimiento de la arsfenamina por el bacteriólogo alemán Paul Ehrlich (Dougherty y Pucci, 2012). Convencido de que el arsénico era clave para curar la sífilis, sintetizó a aparición del segundo antibiótico, esta vez de la mano del patólogo y bacteriólogo Gerhard Domagk, el cual testó en ratones la molécula sulfanilamida, derivada de la sulfonamida, dándose cuenta de que protegía a los ratones del ataque de los estreptococos de la especie Streptoccocus pyo- genes. Alexander Fleming descubrió el primer antibiótico natural, la penicilina, que fue crucial para salvar muchas vidas durante el período más sangriento de la historia de Europa. El descubrimiento de la penicilina fue completamente accidental, ya que lo que realmente estaba investigando Fleming eran las propiedades del Staphylococcus. En 1928, al volver de sus vacaciones observó como una de sus placas de petri había sido contaminada con un hongo, habiendo destruido casi completamente las colonias de Staphylococcus a su alrededor. Con el tiempo identificó que el hongo pertenecía a la familia Penicillium y, más tarde, identificó la sustancia llamándola penicilina (Figura 4). En 1945, Dorothy Hodgkin determinó su estructura, la primera de un antibiótico, por cristalografía de rayos X. Los científicos que descubrieron los tres primeros antibióticos obtuvieron el premio Nobel de Medicina, viéndose recompensado el gran aporte que hicieron al aumento de la esperanza de vida.

Hoy en día existen antibióticos con estructuras químicas de naturaleza muy diversa lo que da a lugar a mecanismos de acción diferentes. Pero ¿por qué son efectivos? Estos modos de acción esencialmente impactan negativamente en  el metabolismo bacteriano de manera que el individuo puede controlar la infección. A grandes rasgos se pueden clasificar a los antibióticos en dos grupos: los bacteriostáticos, en el caso que impidan la multiplicación de las bacterias, y los bactericidas, que directamente matan al microorganismo. Las sulfonamidas son un ejemplo de acción bacteriostática, ya que al interrumpir el metabolismo normal del ADN bacteriano inhibiendo la enzima dihidropteroato sintetasa, impiden su replicación y por tanto la división bacteriana. Un clásico ejemplo de  un antibiótico bactericida es la penicilina y sus derivados que interrumpen la síntesis normal de la pared bacteriana, inhibiendo la enzima DD-transpeptidasa, generando una gran vulnerabilidad en la bacteria lo que provoca su muerte (Figura 4). Estos son algunos de los modos en que un antibiótico interrumpe funciones en los circuitos fisiológicos y metabólicos de las bacterias, funciones que en su gran mayoría están ligadas a proteínas que llevan a cabo una función específica. En resumen, a nivel molecular, los antibióticos interactúan mayormente con proteínas diana específicas alterando su actividad, lo que finalmente afecta la capacidad de supervivencia de las bacterias.

Figura 4. A. Las proteínas con función fisiológica esencial para la vida de la bacteria son dia- na de antibióticos que las inhiben o impiden su normal función. Aquí mostramos la proteína PBP6 de Escherichia coli, involucrada en la construcción de la pared bacteriana (síntesis de peptidoglicano), que puede ser inhibida irreversiblemente con antibióticos beta lactámicos, como la penicilina. B. Los microorganismos, bajo la presión selectiva de estos antibióticos, son seleccionados en base a su resistencia, que viene dada por mutaciones en la proteína diana, o por poseer proteínas que puedan de algún modo neutralizar el antibiótico, como es el caso de las enzimas beta lactamasas que hidrolizan los beta lactamicos, haciendo al microorganismo invulnerable al antibiótico. Para revertir esta resistencia, actualmente se ad- ministran inhibidores de beta lactamasas durante el tratamiento, impidiendo la actividad de éstas enzimas por lo cual se rescata la acción del antibiótico. La biología estructural aporta información para entender el modo de acción de éstos fármacos y a partir de la información de la estructura atómica mejorar y diseñar nuevos fármacos.

Figura 4. A. Las proteínas con función fisiológica esencial para la vida de la bacteria son dia- na de antibióticos que las inhiben o impiden su normal función. Aquí mostramos la proteína PBP6 de Escherichia coli, involucrada en la construcción de la pared bacteriana (síntesis de peptidoglicano), que puede ser inhibida irreversiblemente con antibióticos beta lactámicos, como la penicilina. B. Los microorganismos, bajo la presión selectiva de estos antibióticos, son seleccionados en base a su resistencia, que viene dada por mutaciones en la proteína diana, o por poseer proteínas que puedan de algún modo neutralizar el antibiótico, como es el caso de las enzimas beta lactamasas que hidrolizan los beta lactamicos, haciendo al microorganismo invulnerable al antibiótico. Para revertir esta resistencia, actualmente se ad- ministran inhibidores de beta lactamasas durante el tratamiento, impidiendo la actividad de éstas enzimas por lo cual se rescata la acción del antibiótico. La biología estructural aporta información para entender el modo de acción de éstos fármacos y a partir de la información de la estructura atómica mejorar y diseñar nuevos fármacos.

“Las plataformas de biología estructural producen beneficios directos para el avance de la ciencia y tienen implicaciones directas en la sociedad, como motor económico y como herramientas para la mejora de la calidad de vida”

¿Por qué emergen las bacterias resistentes a los antibióticos? El uso de nuevos conocimientos científicos ha requerido, en ciertas ocasiones, de un período de aprendizaje para su buen uso. Con poco más de un siglo de experiencia en el manejo de antibióticos resultados indeseables e inesperados han surgido. Quizás el más grave de ellos haya sido la aparición de bacterias que, originalmente vulnerables a tratamientos quimioterápicos, han devenido resistentes (Figura 4). Este proceso tiene su origen en la selección natural de aquellos microorganismos resistentes a los antibióticos, siendo estos últimos una nueva presión de selección. Este fenómeno se ve exacerbado por el uso irracional de antibióticos, como se ha observado desde casi el despertar de la era antibiótica cuando, por ejemplo, el uso generalizado e indiscriminado de sulfonamidas en los frentes de batalla dió lugar a los primeros casos de cepas de Streptococcus pyogenes resistentes en hospitales militares. Este es un fenómeno muy preocupante en la actualidad, ya que representa un retroceso en nuestra capacidad de com- batir las enfermedades infecciosas, corriendo el riesgo de volver a una virtual era pre-antibiótica. La cristalografía de rayos X ha contribuido de una manera excepcional en la determinación no solo de las estructuras de antibióticos, sino también de las proteínas diana y de aquellas involucradas en los  mecanismos de resistencia. Dichas estructuras han originado un volumen de conocimiento que resulta fundamental para la comprensión del funcionamiento de los antibióticos, permitiéndonos introducir mejoras en su actividad (Figura 4).

Descubrimiento y desarrollo de antibióticos contra Mycobacterium tuberculosis: un desafío mayor.

Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis, es el segundo agente infeccioso que más muertes causa en el mundo por detrás del HIV. La tuberculosis continúa siendo un grave problema sanitario a nivel mundial, cau- sando la muerte de aproximadamente 1.5 millones de personas al año. A su vez, se estima que la tercera parte de la población mundial esta infectada y es portadora de la forma latente de la bacteria. El tratamiento de la enfermedad es un proceso lento y laborioso, que requiere la administración de dos a cuatro fármacos de primera línea, incluyendo rifampicina, isoniazida, etambutol y pirazinamida, a lo largo de seis meses, y cuya adherencia por parte del paciente suele ser baja. Muy recientemente se ha detectado un marcado aumento en    el número de cepas resistentes (MDR) y de cepas extremadamente-resistentes (XDR) de la bacteria en todo el mundo. La aparición de estas últimas es un hecho alarmante ya que presentan resistencia no sólo a la rifampicina e isoniazida, sino también a tres o más de las seis clases de antibióticos de segunda línea con los cuales la tuberculosis es tratable, lo que ha convertido en una necesidad urgente el descubrimiento de nuevos fármacos (WHO Report 2014).

“Los nuevos avances en crio-microscopía electrónica tienen implicaciones directas en biomedicina y salud”

La envoltura celular de M. tuberculosis es particularmente robusta, basada en glicanos y lípidos de estructura excepcional que juegan un papel esencial en el mantenimiento y la compartimentación celular al igual que en la patogénesis de la tuberculosis. Esta estructura química compleja le confiere a la bacteria una escasa permeabilidad celular, siendo responsable de la ineficacia de múltiples agentes antimicrobianos utilizados comúnmente para el tratamiento  infecciones causadas por bacterias Gram positivas y Gram negativas (Zumla et al. 2013b). Por consecuencia, la pared celular es un foco de estudio muy intenso con el objetivo de identificar nuevas proteínas dianas para el descubrimiento y desarrollo de agentes anti-micobacterianos (Jackson et al. 2013). La pared celular micobacteriana se compone de tres segmentos principales. En la parte más interna se encuentra la membrana plasmática. La parte central de la pared, es conocida como el complejo micolil arabinogalactan-peptidoglicano. El ácido mi- cólico forma la parte interna de la membrana asimétrica externa, mientras que la parte externa está compuesta por (glico)lípidos, lipoglicanos y (lipo)proteínas. La capa más externa de la pared celular consiste en una estructura de bajo empaquetamiento denominada cápsula, que principalmente se compone de polisacáridos y proteínas con un porcentaje minoritario de lípidos. El objetivo a largo plazo de nuestro grupo de investigación, el grupo de Glicobiología Estruc- tural (Figura 5), es el de contribuir en el estudio de los determinantes estructurales y la modulación de la especificidad de sustrato de proteínas involucradas en la biosíntesis y modificación de glicanos.

Figura 5. Grupo de Glicobiologia Estructural. Arriba de izquierda a derecha: Ander Eguskiza, Itziar Gonzalez-Moro, Javier Cifuente, David Albesa-Jove, Marcelo Guerin (head), Aritz Durana y Enea Sancho-Vaello. Abajo de izquierda a derecha: Mikel Garcia, Ane Rodrigo-Unzueta, Na- talia Comino y Montse Tersa.

Figura 5. Grupo de Glicobiologia Estructural. Arriba de izquierda a derecha: Ander Eguskiza, Itziar Gonzalez-Moro, Javier Cifuente, David Albesa-Jove, Marcelo Guerin (head), Aritz Durana y Enea Sancho-Vaello. Abajo de izquierda a derecha: Mikel Garcia, Ane Rodrigo-Unzueta, Na- talia Comino y Montse Tersa.

La búsqueda de alternativas terapéuticas que permitan combatir la tuberculosis nos ha llevado a interesarnos en proteínas involucradas en la síntesis de la envoltura celular de M. tuberculosis. En particular, aquellas que participan de la biosíntesis de fosfatidilinositol ma- nosidos (PIMs) y sus derivados, lipomanano (LM) y lipoarabinomanano (LAM). Los PIMs se encuentran unidos de forma no covalente mediante su residuo fosfatidilinositol a la membrana plasmática y a la membrana externa de la pared celular (Guerin et al., 2010). Pueden contener de uno a seis residuos de manosa y hasta cuatro cadenas alquílicas, siendo el fosfatidilinositol dimanosido (PIM2) y el hexamanosido (PIM6) tri- o tetra-acilados las especies mayoritarias in vivo. Hemos avanzado marcadamente en el conocimiento molecular de PimA, una enzima esencial para el crecimiento de M. tuberculosis y responsable de catalizar el primer paso en la ruta de síntesis de los PIMs (Boldrin et al., 2014). PimA es una glicosiltransferasa que cataliza la transferencia del primer residuo de manosa a un lipido aceptor, que se encuentra anclado en la membrana, el fosfatidilinositol (Albesa-Jove et al. 2014). Evidencias experimentales sugieren que la reacción se lleva a cabo en la interfaz entre la membrana y el citosol, gracias a la capacidad estructural de la enzima de acceder tanto a un sustrato hidrofílico, en este caso el GDP-Manosa que se encuentra en solución, como también al sustrato hidrofóbico embebido en la membrana. La estructura cristalina de PimA reveló que está compuesta de dos dominios con un plegamiento de tipo Rossmann, separados por un surco central importante donde se unen los sus- tratos y se lleva a cabo la catálisis (Guerin et al., 2007; Guerin et al., 2009; Giganti et al., 2013). Recientemente, hemos observado que esta enzima adopta diferen- tes estados conformacionales sin precedentes, un hallazgo que representa un avance en el conocimiento no sólo del mecanismo molecular de PimA, sino de proteínas que se asocian a membrana en general. Por primera vez hemos podido observar como una glicosiltransferasa es capaz de cambiar su conformacion mediante transiciones en su estructura secundaria de tipo β-strand–to–α-helix y α-helix–to–β-strand (Giganti et al., 2015; Figura 6). Estos cambios estructurales parecen modular la catálisis y estar promovidos por su interacción con los sus- tratos y/o con la membrana.

Figura 6. Reordenamientos estructurales de tipo hebra-β-a-hélice-α y hélice-α-a-hebra-β  en la enzima PimA, visualizados en sus distintas estructuras obtenidas por cristalografia de rayos X.

Figura 6. Reordenamientos estructurales de tipo hebra-β-a-hélice-α y hélice-α-a-hebra-β en la enzima PimA, visualizados en sus distintas estructuras obtenidas por cristalografia de rayos X.

El Grupo de Glicobiología Estructural participa activamente en el proyecto MM4TB – More Medicines for Tuberculosis, financiado por el VII Programa Mar- co de la Unión Europea, con un presupuesto de 16 millones de euros.   MM4TB se ha constituido con el objetivo de contribuir al descubrimiento de nuevos fármacos que permitan combatir la tuberculosis. En concreto, el consorcio se plantea validar farmacológicamente al menos cinco nuevas dianas y descubrir al menos una familia de candidatos a fármacos susceptibles de ser transferidos a compañías biotecnológicas y farmacéuticas asociadas, para su futuro desarro- llo. La obtención de inhibidores contra la enzima PimA representa un desafío sin precedentes. El equipo que se ha reunido en torno a MM4TB utiliza un enfoque multidisciplinar e integral, incluyendo estrategias de screening tripartito y quí- mica medicinal, genómica funcional y biología estructural. En dicho consorcio participan, además de nuestro grupo, más de 20 grupos punteros de investiga- ción europeos, entre los cuales se encuentran las Universidades de Cambridge (UK), Uppsala (Suecia) y Pavia (Italia), el Instituto Pasteur de Paris (Francia), el ETH (Suiza) la École Polytechnique Fédérale de Lausanne (Suiza), y tres compa- ñías farmacéuticas lideres en el mercado, AstraZeneca, Sanofi-Aventis y Allere Tech GmbH, Dicho consorcio, se consolidó a partir del descubrimiento de una nueva serie de compuestos, las benzotiazinonas (BTZ), actualmente en fase de desarrollo preclínico.

 

La importancia de la Biología Estructural

Figura 2. Biología estructural en el contexto del conocimiento científico

Figura 2. Biología estructural en el contexto del conocimiento científico

Las ciencias experimentales nacen de la curiosidad del ser huma- no por entender el universo que lo rodea. Mediante la observación sistemática y el análisis racional, la ciencia permite la conceptualización, clasificación y el ordenamiento del conocimiento científico. Esto lleva al planteamiento de modelos, que sometidos a perma- nente revaluación, tratan de explicar los fenómenos observados. En este marco se genera el concepto de estructura que surge de observar el orden interno de las entidades-objeto, los patrones que forman y en sumatoria resultan en un modelo de arquitec- tura del cosmos. Estas estructuras se clasifican, desde el punto   de vista del tamaño, dentro de un rango que va desde los límites del universo conocible hasta la medición de las partículas subatómicas. Para el ser humano, dentro de la estructura del universo,   el evento llamado vida es uno de los objetos de estudio de mayor atracción a su curiosidad, no solo por su singularidad y total centralidad en el espacio existencial del hombre, sino porque el avance en el conocimiento de la ciencia de la vida, la biología, impacta en el desarrollo de la humanidad. Un ejemplo de buen uso de este conocimiento puede corroborarse en cómo se ha afectado positivamente la calidad y el aumento de la esperanza de vida del ser humano al surgir la era antibiótica. El campo biológico actual esta enmarcado en un rango de tamaño que va desde la biosfera a la biofísico-química, y es a este nivel, el de la interacción  de los átomos y moléculas donde se genera mucho del conocimiento fundamental. Ésta última región del estudio biológico, corresponde a las estructuras que no se pueden observar por medio de instrumentos ópticos del rango visible y es donde se define la biología estructural. La elucidación de estructuras biológicas se puede obtener por medio de diferentes técnicas. Las tres principales son la cristalografía de rayos X, la microscopía electrónica y la resonancia magnética nuclear. Estas técnicas son complementarias, ya que cada una aporta diferentes visiones de los objetos tanto por limitación de escala, resolución, flexibilidad o condición de preparación de la muestra de estudio. La biología estructural nace con la cristalografía de moléculas biológicas.  Su fundamento es la iluminación de éstas moléculas ordenadas periódicamente, por ejemplo con rayos X, para obtener el patrón de difracción de cuyo análisis se extraen las posiciones atómicas de la molécula. Por medio de esta poderosa técnica    se estudian maquinarias biológicas completas como el riboso- ma (complejos supramacromoleculares), proteínas en diversos estados conformacionales como PimA, complejos enzima-sustrato como los complejos de Michaelis de la enzima GpgS. La técnica sigue avanzando y últimamente el desarrollo de méto- dos de colecta de difracción de un flujo de cristales en solución (Time resolved crystallography) ha permitido observar cambios conformacionales en tiempo real, como el del centro reactivo   de los fotosistemas tras la excitación por luz. Otra técnica importante en el campo es la microscopía electrónica, que usa haces de electrones que viajan enfocados por lentes magnéticas a través de la muestra interpuesta, soportada a una rejilla, análogamente a rayos de luz en un microscopio óptico. En su origen la muestra biológica necesitaba ser teñida con metales pesados para poder ser observada, actualmente, con el desarrollo de la microscopía en fase criogénica, la muestra se man- tiene en una fase acuosa vítrea a temperaturas de nitrógeno liquido, con lo cual las moléculas biológicas se hallan en estado nativo. Esta técnica también permite estudiar complejos supramacromoleculares, como complejos virus receptor, así como proteínas de mediano peso molecular. Hoy con esta téc- nica ya se pueden obtener estructuras atómicas. Por último, la resonancia magnética nuclear (NMR) usa la propiedad de ciertos núcleos atómicos de desdoblar sus estados energéticos en presencia de un potente campo magnético externo y al ser excitados, usando un pulso de radiofrecuencia, provocan una respuesta de resonancia cuya resultante es el espectro NMR, que a partir de su análisis permite obtener información de la estructura, su entorno químico y su dinámica molecular, esto último característica sobresaliente de la técnica.

 

Referencias

[1] Camus A. La Peste (1947).

[2] Mollaret HH y Brossollet J. Yersin. Un pasteurien en Indochine (1985).

[3] Deville P. Peste y Cólera. (2014).

[4] Simond M et al. Paul-Louis Simond and his discovery of plague transmission by rat fleas: a centenary. J. R. Soc. Med. 91, 101-104 (1998).

[5] Zumla A et al. Tuberculosis. Engl. J. Med. 368, 745-55 (2013). Review.

[6] Blundell TL y Johnson LN. Protein Crystallography (1976).

[7] Bragg WH y Bragg WL. The Reflection of X-rays by Crystals. Proceedings of the Royal Society of London A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences, 88, 428–438 (1913).

[8] Pauling L. y Corey RB. Configurations of Polypeptide Chains With Favored Orientations Around Single Bonds: Two New Pleated Sheets. Proc Natl Acad Sci U S A., 37, 729–40 (1951).

[9] Dougherty TJ y Pucci MJ. Antibiotic discovery and development (2012).

[10] WHO | Global tuberculosis report 2014.

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