El metaboloma como herramienta diagnóstica

Oscar Millet

Jefe de la línea e investigador principal del Laboratorio de Estabilidad de Proteínas y Enfermedades Congénitas de CIC bioGUNE. Experto en la aplicación de la RMN al estudio de biomoléculas, particularmente proteínas, y como su pérdida de estabilidad implica la aparición de patologías.

La metabolómica consiste en el estudio de los compuestos químicos pequeños que resultan de los procesos del metabolismo celular. La hipótesis es que la composición del conjunto de metabolitos (metaboloma) contiene suficiente información acerca del estado patogénico de las células y por ende del organismo que las contiene. La metabolómica realiza un riguroso análisis cuantitativo del metaboloma de muestras de biofluídos (típicamente orina y sangre) con el fin de identificar biomarcadores tempranos para el diagnóstico y pronóstico de todo tipo de enfermedades.

El valor diagnóstico de la orina y la sangre

A lo largo de la historia, la comprensión del funcionamiento del ser humano y la preservación de la salud han estado íntimamente ligados a nuestra capacidad de entender e interpretar los fluidos corporales. En la antigua Grecia, Hipócrates, conocido como el padre de la medicina occidental, mentó en varias ocasiones la relevancia diagnóstica de la orina: “Ningún otro sistema u órgano del organismo humano proporciona tanta información por su excreción como lo hace el sistema urinario”, escribió. Galeno, por su parte, postula que venas y arterias sirven para la circulación de sangre (y no de aire), pero erróneamente indica que el fluido se genera en el hígado y se consume en el resto de vísceras. Esta noción primitiva del funcionamiento del cuerpo humano se transmitió sin grandes cambios a la medicina medieval, donde el carácter de cada persona estaba basado en un balance único de los cuatro humores básicos (sangre, flema, cólera y melancolía) que daban lugar a los diferentes tipos de temperamentos: sanguíneo, flemático, colérico y melancólico. En este contexto, la enfermedad se consideraba como un mero desequilibrio en el balance de las relaciones humorales del individuo. Así, en ausencia de análisis de sangre y radiografías, los médicos confiaban en los botes de orina para diagnosticar a las personas enfermas, en total sintonía con la fisiología Galénica. Los facultativos a menudo aventuraban un diagnóstico tan solo después de observar el color, el olor y el sabor de la orina del paciente.

“Un biofluído como la orina contiene suficiente información sobre el estado metabólico del organismo que la ha generado”

A partir del renacimiento, el acceso progresivo a cadáveres para su disección (en numerosas ocasiones se trataba de presos ajusticiados) facilitó un estudio más metódico de la anatomía del cuerpo humano. Destacan, entre muchos otros, las vanguardistas aportaciones de Vesalius en anatomía y fisiología y, posteriormente, las de Harvey hacia la comprensión del corazón y el sistema circulatorio. Estos avances también impactaron en la manera de encajar la función de los fluidos básicos (orina y sangre) en el rompecabezas del cuerpo humano, pasando del concepto de pneuma en el que el aire respirado por los pulmones se transforma en sangre casi por generación espontánea, a un rol del flujo sanguíneo mucho más concreto y cuantitativo. En paralelo, el descubrimiento de nuevos instrumentos observacionales como el microscopio permitieron acotar y perfeccionar el conocimiento de los órganos y fluidos del organismo y, progresivamente, la medicina se transforma en una verdadera disciplina científica, con metodología rigurosa y carácter predictivo.

Figura 1. Rueda de orinas. Este cuadro contenía 20 colores posibles de orina que iban desde “blanco como agua de pozo” hasta “rojo como oro puro intenso” y “negro como cuerno muy oscuro”.

Figura 1. Rueda de orinas. Este cuadro contenía 20 colores posibles de orina que iban desde
“blanco como agua de pozo” hasta “rojo como oro puro intenso” y “negro como cuerno muy
oscuro”.

Dicha transformación conllevó un incremento del potencial diagnóstico de los biofluidos humanos. Por ejemplo, el cirujano Herbert Mayo utilizaba la orina para diagnosticar síndrome metabólico y sorprende con una analogía culinaria cuando escribe en 1832: “La orina diabética casi siempre es de un color verde pálido o verdoso. Su olor es comúnmente débil y peculiar, a veces se asemeja a suero de leche o leche dulce”. A finales de ese mismo siglo se desarrolla el ensayo de la velocidad de sedimentación de la sangre, atribuida mayormente al patólogo polaco Edmund Biernacki y que ha permitido diagnosticar diversas patologías relacionadas con los procesos inflamatorios.

En la actualidad, la irrupción de la biología celular y molecular y la comprensión de los mecanismos sub-celulares a nivel atómico están alcanzando hitos impensables en biología y en biomedicina. Sin embargo, la práctica asistencial actual aún se sustenta de una base de conocimiento basada en la anatomia y la patofisiología. En este contexto, la descripción molecular de los órganos se limita a la medida de una serie de biomarcadores muy básicos: el correcto funcionamiento del hígado se asocia con un nivel adecuado de transaminasas, el riñón a los niveles de creatinina, el sistema circulatorio a la (no) acumulación de colesterol, etc… La hipótesis es que, tal y como aventuraba Hipócrates, la orina (y otros fluidos como el suero) codifican mucha información en la naturaleza y concentración de sus metabolitos, y que ésta es suficiente para diagnosticar y/o pronosticar un número relevante de patologías.

Metabolómica de orina y suero

El metabolismo se define como la totalidad de reacciones químicas que se dan en un organismo vivo. La metabolómica es el estudio de las moléculas de pequeño tamaño (menores de 1000 Da) que se encuentran en un material biológico, como suero, orina o cualquier órgano, tejido o célula. Estos compuestos, denominados metabolitos, pueden ser intermediarios metabólicos, moléculas señalizadoras, hormonas, antibióticos… y estan íntimamente implicados en una plétora de funciones celulares como la energética, el crecimiento, la división celular, el mantenimiento de la estructura celular y la respuesta a estímulos, entre muchos otros. Cualquier alteración que se produzca en el ADN, ARN o en las proteínas constituyentes, por sutil que sea, es preceptiva de provocar cambios sustanciales en las concentraciones de determinados metabolitos (que se erigen en potenciales biomarcadores). Una correcta detección y cuantificación de estos biomarcadores metabólicos está cobrando una creciente importancia para la prevención, diagnóstico y pronóstico de enfermedades de diversa índole, como las neuropatías (Alzheimer o Parkinson), diabetes o los diferentes tipos de cáncer.

La orina es uno de los biofluidos más comúnmente utilizados para realizar análisis clínicos y también metabolómicos. La orina ofrece más ventajas que otros fluidos a la hora de utilizarlo para análisis metabolómicos debido a su relativamente menor grado de complejidad, menor interacción molecular, menor contenido proteico, así como a su fácil procedimiento de obtención. En concreto, las muestras de orina pueden obtenerse de manera fácil e indolora, a diferencia de otras muestras biológicas que pueden llegar a ser inaccesibles o generar un episodio traumático en el donante, particularmente en neonatos o infantes. La orina contiene una composición bioquímica única y característica que proviene de una combinación de factores como el genotipo, el estado fisiológico, nutricional, ambiental etc. De hecho, la función excretora de la orina la hace particularmente apropiada para monitorizar el estado global de un organismo. El grupo de Bertini en Florencia, en colaboración con el equipo de desarrollo de aplicaciones de Bruker demostraron mediante el análisis de muestras de orina humana que el metabolismo presente en la orina se divide entre una parte invariable e idéntico para todos las muestras y una fracción variable que demuestra que los fenotipos metabólicos individuales existen y que valida la hipótesis de que es posible distinguirlos y analizarlos adecuadamente (Assfalg et al. 2008).

“Un análisis por RMN unido a un riguroso examen estadístico permite extraer dicha información de manera reproducible”

Por su parte, las características propias de los sistemas de salud actuales hacen de la sangre un biofluido muy accesible: es relativamente fácil y económico el obtener una alícuota de sangre de uno de los innumerables análisis de sangre a los que nos sometemos a lo largo de nuestra vida. El suero sanguíneo es rico en proteínas, factores de todo tipo y metabolitos, pero, a diferencia de la orina que es un fluido de excreción, las concentraciones de muchos de sus componentes estén muy tamponadas debido a la importancia estratégica de la sangre en el organismo. Dicho esto, el análisis metabolómico y lipidómico de la sangre ha demostrado ser de gran utilidad en el diagnóstico de numerosos trastornos del metabolismo.

Resonancia Magnética Nuclear y Metabolómica

Al final de los años 60, con la introducción de la transformada de Fourier en la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) y posteriormente en los 70, con la aparición de los imanes superconductores se produjeron los avances tecnológicos necesarios para la aplicación de RNM en metabolismo de biofluidos. Los primeros estudios de metabolómica por RMN datan de los años 80 y se deben mayormente a contribuciones del grupo de Jeremy Nicholson (Nicholson et al, 1983 & 1984). Posteriormente, la aparición de campos magnéticos más intensos y el desarrollo de crio-sondas implicaron un enorme incremento en la sensibilidad de esta técnica y, desde entonces, la RMN de alta resolución ha demostrado su eficiencia en el estudio y análisis metabolómico de todo tipo de biofluidos proporcionando una amplia información del metaboloma en relación a condiciones patológicas o estados fisiológicos de un organismo (Griffin, 2003). La elevada reproducibilidad en las técnicas de RMN proporcionan a esta técnica un gran número de ventajas sobre otras técnicas analíticas: la RMN es una técnica cuantitativa y no destructiva, la preparación directa de las muestras sin necesidad de derivatización, así como la rapidez con la que se pueden hacer medidas la convierten en una técnica muy efectiva, en comparación con los numerosos métodos convencionales que serían necesarios para conseguir los mismos resultados. Todo esto hace que la RMN haya sido utilizada para el estudio de un amplio rango de enfermedades, a través del estudio de sangre, orina, otros fluidos, células y tejidos intactos obtenidos de biopsias.

“Esta técnica exhibe un enorme potencial para la identificación de biomarcadores tempranos frente a enfermedades prevalentes y raras”

El uso de la RMN para el descubrimiento de biomarcadores adolece del hecho de que existen numerosas variables que pueden afectar a la composición metabólica, incluyendo el estrés, ayuno, drogas, género, edad, actividad física, etc. Por ello, es importante identificar y cuantificar el mayor número de metabolitos posible en un número de muestras estadísticamente significativo. En este contexto, el grupo de Wishart ha desarrollado una base de datos en la que se detallan unos 2600 metabolitos encontrados en la orina de humanos (http://urinemetabolome.ca), con sus estructuras, concentraciones, así como asociación con enfermedades conocidas (Bouatra el al, 2013).

Actualmente, ¿Que información podemos obtener?

La orina es un fluido muy rico en metabolitos que además están sobrerepresentados con respecto a otras concentraciones puesto que la cantidad de orina excretada es limitada. Por defecto se encuentran un buen número de metabolitos hidrosolubles correspondientes al metabolismo primario: amino ácidos, cofactores y grupos prostéticos, mensajeros de señalización secundario, bases nucleicas y un buen número de mono y oligosacáridos. Por contra la concentración de proteínas en orina (proteinuria) es más bien limitada. Mediante la técnica de RMN, estos metabolitos se pueden contrastar dando pie al establecimiento de modelos metabólicos de la población (vide infra).

“A través de los espectros de RMN es posible realizar un análisis conjunto del metaboloma mediante la cuantificación de las zonas del espectro de RMN y su posterior análisis estadístico”

Dada la relación funcional de este fluido con el organismo, la orina también es una fuente de información de xenobióticos y productos de degradación metabólica. Si bien esto se da para muchas rutas del metabolismo, tan solo unas pocas rutas producen productos de degradación a concentraciones lo suficientemente altas como para que se puedan detectar en un espectro de RMN. Esta situación cambia en presencia de un tratamiento farmacológico, donde los productos de degradación del principio activo administrado acostumbran a ser fácilmente identificables en una muestra de orina.

Figura 2. Espectro de RMN monodimensional y bidimensional (inserto) de una muestra de orina, en el que se aprecia la gran riqueza informativa de la muestra.

Figura 2. Espectro de RMN monodimensional y bidimensional (inserto) de una muestra de
orina, en el que se aprecia la gran riqueza informativa de la muestra.

Finalmente, la orina también contiene algunos metabolitos de origen no humano y que son resultado de los procesos simbióticos con la flora intestinal (microbiota) que tenemos en el tracto intestinal. El análisis de estos compuestos complementa bien un análisis de diversidad de la microbiota, normalmente obtenido a partir de una muestra de heces.

Por su parte el suero, cuando se analiza mediante RMN, proporciona información cuantitativa de un número limitado de metabolitos que además no acostumbra a ser muy informativo puesto que sus concentraciones se encuentran altamente reguladas. Sin embargo, una fracción importante del espectro está dominada por las lipoproteínas y su análisis sí que proporciona información muy valiosa acerca del circulante de triglicéridos y del ciclo de los ácidos grasos y el colesterol.

Metabolómica en neonatos y adultos

En el CIC bioGUNE, y en estrecha colaboración con la empresa Bruker, se ha puesto a punto una metodología para el diagnóstico de diversas patologías en neonatos, basada en el análisis metabolómico de muestras de suero, plasma y orina mediante RMN de alto campo. Para ello se dispone de un equipo especialmente diseñado para el análisis metabolómico de muestras y que cumple con todos los protocolos normalizados de trabajo, requisito imprescindible para una adecuada reproducibilidad de los resultados. A través de los espectros de RMN es posible realizar un análisis conjunto del metaboloma mediante la cuantificación de las zonas del espectro de RMN y su posterior análisis estadístico. Por otra parte, dado que los observables obtenidos de los espectros de RMN contienen una gran información estructural, también es pertinente obtener información acerca de la naturaleza de los metabolitos responsables de dicha variabilidad.

Entre los proyectos en los que se trabaja en nuestro laboratorio, destaca el análisis de orina de neonatos con el fin de detectar evidencias metabólicas derivadas de una serie de enfermedades congénitas. El objetivo a largo plazo es el de crear una herramienta de apoyo al diagnóstico de desórdenes de carácter metabólico. En concreto, se pretende investigar si existen evidencias experimentales para detectar patologías no frecuentes derivadas de deficiencias congénitas en el metabolismo de carbohidratos, ácidos grasos, lípidos, purinas, pirimidinas etc. Al mismo tiempo se está creando un modelo metabólico de la población neonatal con el fin de determinar cuál es la variabilidad intrínseca en las muestras de orina teniendo en cuenta los factores geográficos, dietarios y los hábitos de la población de este entorno geográfico.

“Se están analizando muestras de orina de pacientes con cáncer de próstata y de hiperplasia benigna de próstata con el fin de discriminar metabólicamente a ambos grupos”

También se trabaja en la detección de biomarcadores en enfermedades hepáticas y en cáncer de próstata. Concretamente se ha analizado suero de pacientes portadores del virus de la Hepatitis C que ha progresado a cirrosis frente a los que no la han desarrollado y se han detectado varios metabolitos que pueden encontrarse involucrados en el desarrollo de la cirrosis hepática (Embade et al. 2016). En el caso de cáncer de próstata, se están analizando muestras de orina de pacientes con cáncer de próstata y de hiperplasia benigna de próstata con el fin de discriminar metabólicamente a ambos grupos.

Finalmente, también se está desarrollando un ambicioso proyecto para evaluar la “salud metabólica” en adultos, que pretende contestar preguntas como ¿se corresponde nuestra “edad biológica” con nuestra “edad metabólica”? Se está implementando la metodología desarrollada en la monitorización de perfiles normales y patológicos de una porción significativa de la población de la CAPV (como región de estudio). Ya se han obtenido más de 20.000 muestras de orina y de suero de las que se están cuantificando alrededor de 150 metabolitos, pertenecientes mayormente al metabolismo primario. Se trata de crear un modelo metabolómico avanzado de la población adulta que pueda ser contrastado frente a muestras de pacientes de un gran número de enfermedades.

Figura 3. Espectro monodimensional de una muestra de suero humano. Los números indican los picos correspondientes a metabolitos que se han identificado y que se pueden cuantificar.

Figura 3. Espectro monodimensional de una muestra de suero humano. Los números indican
los picos correspondientes a metabolitos que se han identificado y que se pueden
cuantificar.

Figura 4. Espectrómetro IVDr de 600 MHz del CIC bioGUNE, dedicado al análisis metabolómico de muestras de suero y orina.

Figura 4. Espectrómetro IVDr de 600 MHz del CIC bioGUNE, dedicado al análisis metabolómico
de muestras de suero y orina.

Referencias

[1] Assfalg et al. Evidence of different metabolic phenotypes in
humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 5;105(5):1420-4.

[2] Bouatra et al. The human urine metabolome. PLoS One, 2013 Sep 4;8(9).

[3] Embade et al. Metabolic Characterization of Advanced Liver Fibrosis in HCV
Patients as Studied by Serum 1H-NMR Spectroscopy. PLoS One, 2016 9;
11(5):e0155094.

[4] Griffin JL, Metabonomics: NMR spectroscopy and pattern recognition
analysis of body fluids and tissues for characterisation of xenobiotic toxicity
and disease diagnosis. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003 Oct;7(5):648-54.

[5] Nicholson et al. High resolution 1H N.M.R. studies of vertebrate blood and
plasma. Biochem J. 1983 Jun 1;211(3):605.

[6] Nicholson et al. Proton-nuclear-magnetic-resonance studies of serum, plasma
and urine from fasting normal and diabetic subjects Biochem J. 1984 Jan 15;
217(2):365-75.

 

 

 

 

image_print

Dejar un comentario

Uso de cookies

Este sitio web utiliza cookies para que usted tenga la mejor experiencia de usuario. Si continúa navegando está dando su consentimiento para la aceptación de las mencionadas cookies y la aceptación de nuestra política de cookies, pinche el enlace para mayor información.

ACEPTAR
Aviso de cookies